近年来，液体活检因其低侵入性特点以及能够进行频繁或连续的样本采集而备受瞩目。这一技术能够有效追踪肿瘤进展及治疗反应。其中，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）作为细胞释放的一种膜结构，含有多种生物分子，包括脂质、蛋白质和RNA。由于它们能真实反映活体细胞的状态，越来越多的研究将EV用于生物标志物的开发。

已有研究表明，EV中的miRNA生物标志物面板的诊断性能普遍优于单一生物标志物，且血浆中的EV-miRNA在诊断价值上略高于血清不同。另外，有研究分析了前列腺癌患者尿液中的miRNA差异表达，发现10种miRNA可作为早期检测工具。同时，关于EV长链RNA的研究显示，血液来源的EV长链RNA表达谱可作为胰腺导管腺癌的诊断生物标志物，有效区分健康个体与恶性肿瘤患者。

传统方法中，血液中cfRNA的研究多依赖短读长测序，但这种方法在解析全长转录本异构体以及复杂的RNA加工事件方面存在局限性。相比之下，cfRNA中的EV RNA因其完整性和较长的长度，使得采用长读长RNA测序技术能够直接进行全长转录本的测序，发现更多新型RNA异构体，从而实现更高效且准确的临床应用。

来自利来国际的Daniel Kim研究小组也意识到了长读长测序的优势，将其应用于血液EV RNA的检测，以验证EV RNA在疾病诊断中的作用。研究发现，现有基于DNA的液体活检方法可能会忽略癌症早期阶段，而早期诊断能够使治疗尽早进行，最终降低死亡率。该研究小组通过COMPLETE-seq RNA流程，采用高特异性的膜亲和技术及硅胶膜柱法提取血浆EV RNA，然后结合纳米孔长读长技术与短读长技术进行测序，从而获取EV RNA转录组的全面信息。

研究结果表明，血液中存在丰富的重复RNA序列，具有疾病特异性，可作为诊断生物标志物。相关研究成果已在国际期刊Nature Biomedical Engineering上发表。通过使用COMPLETE-seq RNA流程，研究小组首先从血浆中提取EV RNA，再将其反转录为cDNA进行文库制备。接着进行短读长测序和基于纳米孔技术的长读长测序，最后进行基因的差异表达分析及cfRNA长度分析。

长读长RNA测序过程中发现，胰腺癌患者的cfRNA大多来源于重复序列，主要包括SINE元件。这项研究使用来自癌症基因组图谱计划（TCGA）的食道癌测序数据，以及GTEx联盟中的正常样本，探测癌症特异性食道RNA特征，结果显示“数百个重复衍生的转录本在食道癌中显著富集”。这进一步表明重复RNA序列作为疾病特异性诊断生物标志物的潜力。

以往研究多认为，血浆中的cfRNA往往短小且降解，但通过全长cDNA纳米孔测序，研究表明胰腺癌患者的cfRNA可显示出不同的特征。长读长测序数据显示：mRNA长度可达1,337 nt（中位数456 nt），lncRNA为970 nt（中位数303 nt），LINE为1,002 nt（中位数258 nt），SINE为368 nt（中位数185 nt），LTR为477 nt（中位数167 nt）。这些结果揭示了全长、多腺苷酸化及带帽子RNA分子的存在，其中包括lncRNA。

利来国际在这项研究中首先将健康对照及胰腺癌患者的血液样本分离为血浆，随后采用exoRNeasy（QIAGEN）试剂盒处理形成的血浆，提取EV RNA，最终进行cfRNA的长读长和短读长测序。这些长读长测序结果表明，通过使用exoRNeasy试剂盒提取得到的EV RNA具有良好的完整性，无降解现象。

此外，exoRNeasy系列试剂盒支持快速处理各种大体积样本，包括最高4mL血清/血浆、16mL尿液及32mL细胞培养上清。特异性分离EV后，可以直接在柱上完成裂解，并结合QIAGEN经典的硅胶膜技术高效提取高纯度总RNA，适用于mRNA、长链非编码RNA及miRNA等多种小RNA的检测与分析。如果仅需分离EV，可选择exoEasy Maxi Kit，同样基于亲和膜技术，无需超速离心，25分钟即可完成细胞外囊泡的特异性分离。

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